一、任務(wù)目的

·；熟悉利用低溫、干燥、缺氧等進(jìn)行菌種保藏的原理。

·；掌握菌種常用保藏技術(shù)。

二、任務(wù)原理

保藏菌種一般以試管的形式進(jìn)行保存。菌種保藏的基本原理是盡可能地降低菌絲的生理代謝活動(dòng)，使生命活動(dòng)處于休眠狀態(tài)，從而達(dá)到菌種保藏的目的。通常采用干燥、低溫、冷凍及缺氧、真空等手段進(jìn)行菌種保藏。

三、材料與儀器

母種試管、PDA試管斜面，麥粒、液狀石蠟（裝入三角瓶中，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，40℃干燥箱烘干水分后備用）、濾紙條（裝入培養(yǎng)皿中經(jīng)1.05kg/cm2高壓蒸汽滅菌后備用）、滅菌插菇鐵絲架、無(wú)菌帶棉塞空試管、超凈化工作臺(tái)、接種用具、無(wú)菌鑷子、固體石蠟、坩堝、酒精燈、試管架、塑料薄膜、牛皮紙、捆扎繩、標(biāo)簽、普通冰箱等。

四、任務(wù)實(shí)施

1.斜面低溫保藏法

將保藏的母種接入PDA斜面培養(yǎng)基中，待菌絲長(zhǎng)至斜面的2/3時(shí)，選擇菌絲生長(zhǎng)粗壯整齊的母種試管，將試管口的棉塞用剪刀剪平。利用酒精燈在坩堝里溶化固體石蠟，用于密封試管口，在外包扎一層塑料薄膜，后將試管斜面朝下放入4℃冰箱里保存。有效保藏期一般為3～6個(gè)月，好在2～3個(gè)月時(shí)轉(zhuǎn)管。如用無(wú)菌膠塞封口的菌種，在冰箱中可保藏3年之久，仍具有很強(qiáng)的生活力。保藏的菌種在使用時(shí)應(yīng)提前12～24h從冰箱中取出，經(jīng)過(guò)適溫后恢復(fù)活力方能轉(zhuǎn)管。

2.麥粒培養(yǎng)基保藏法

選擇顆粒飽滿、新鮮、無(wú)病蟲害的小麥粒，用清水浸泡10h左右，濾干后分裝入試管，容量為試管長(zhǎng)度的1/3，塞好棉塞，在1.05kg/cm2壓力下滅菌1h，28℃培養(yǎng)24h后，再在1.05kg/cm2壓力下滅菌1h。在無(wú)菌操作下，將要保藏的菌種接入滅菌好的麥粒培養(yǎng)基內(nèi)。在25℃下培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基后，在無(wú)菌操作下?lián)Q上無(wú)菌膠塞并蠟封，放入4℃左右冰箱內(nèi)保藏。使用時(shí)，在無(wú)菌操作下，將每支斜面培養(yǎng)基中央接入少量麥粒，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面即可。采用麥粒培養(yǎng)基作為保藏菌種的培養(yǎng)基，可保藏菌種1年以上。

3.液狀石蠟保藏法

將需要保存的菌種接到培養(yǎng)基上，好用綜合馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，在適溫下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿斜面。然后把液狀石蠟裝于三角瓶中，裝至瓶體1/3處，塞上棉塞，并包紙，另將10mL試管若干支也包裝好，在1.05kg/cm2壓力下滅菌1h，再放入100℃烘箱內(nèi)干燥1h，以蒸發(fā)其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接到空白斜面上，在28～30℃下培養(yǎng)2～3d，證明無(wú)雜菌生長(zhǎng)方可使用。然后用無(wú)菌操作的方法把液狀石蠟注入待保藏的斜面試管中。注入量以高出培養(yǎng)基斜面1～1.5cm，塞上橡皮塞，用固體石蠟封口，直立于低溫干燥處保藏。保藏時(shí)間在一年以上，在低溫下，保藏時(shí)間還可延長(zhǎng)。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

（1）結(jié)果分析　分析菌種保藏存活率低的原因。

（2）問題討論　觀察結(jié)果并對(duì)出現(xiàn)的問題進(jìn)行分析、討論。